2226-5988 2686-6749 Клиническая и экспериментальная морфология Clinical and Experimental Morphology ООО "Группа МДВ" 10.31088/cem2023.12.4.62-70 Морфологическое исследование процессов валлеровской дегенерации в седалищном нерве крысы после механического повреждения Morphological analysis of Wallerian degeneration in the rat sciatic nerve following mechanical damage Петрова Елена Сергеевна Петрова Елена Сергеевна Petrova Elena S. iempes@yandex.ru 0000-0003-0972-8658 Колос Елена Андреевна Колос Елена Андреевна Kolos Elena A. cem.journal@mail.ru 0000-0002-9643-6831 ФГБНУ Институт экспериментальной медицины (Санкт-Петербург, Россия) Institute of Experimental Medicine (Saint Petersburg, Russia) 25 12 2023 2023 12 4 62 70 07 12 2022 10 04 2023 22 12 2022

Введение. Травма периферических нервных проводников является важной социально значимой проблемой. Для разработки новых способов стимуляции регенерации поврежденных нервов необходимы углубленные фундаментальные исследования молекулярно-клеточных механизмов, регулирующих дегенеративные и репаративные процессы, возникающие в нервном стволе в ответ на повреждение. Цель настоящей работы – используя иммуногистохимические и гистохимические методы исследования, изучить структурные изменения, происходящие в дистальном сегменте седалищного нерва крысы в ранние сроки после травмы. Материалы и методы. Седалищный нерв крысы повреждали путем наложения лигатуры в течение 40 секунд. Через 7, 21, 60 суток изучали изменения нервных волокон с помощью иммуногистохимической (ИГХ) реакции на альфа-тубулин и окраски на миелин люксолевым прочным синим. Для исследования клеток периневрия применяли антитела к белку плотных контактов клаудину-1. Шванновские клетки (нейролеммоциты) идентифицировали проведением ИГХ реакции на GFAP, макрофаги — на белок Iba-1. Результаты. Показано, что через 7 суток после наложения лигатуры в эндоневрии дистального сегмента седалищного нерва крысы происходят дегенерация большинства нервных волокон, распад миелиновых оболочек, нарушение гематоневрального барьера, миграция гематогенных макрофагов и дедифференцировка шванновских клеток. Через 21 сутки наблюдаются рост нервных волокон из проксимального сегмента нерва и их ремиелинизация. Через 60 суток их количество достигает наибольшей величины по сравнению с показателями предыдущих сроков. Заключение. Впервые на модели повреждения нерва путем наложения лигатуры (40 секунд) проведена оценка процессов валлеровской дегенерации, используя гистохимические и иммуногистохимические методы. Установлена зависимость между степенью распада миелина и количеством Iba-1+ макрофагов. В дистальном сегменте нерва отмечено нарушение состояния периневрия, выявлены дедифференцированные митотически делящиеся шванновские клетки.

Introduction. Peripheral nerve injury is an important social problem. Fundamental research on mechanisms regulating degenerative and reparative processes that occur in the nerve following injury is necessary to find new ways of improving nerve regeneration. The purpose was to study the structural changes in the distal segment of the rat sciatic nerve at early stages following injury (ligature) using immunohistochemical and histochemical methods. Materials and methods. The rat sciatic nerve was subjected to mechanical trauma through ligation for a duration of 40 seconds. After days 7, 21, and 60, we analyzed changes in the nerve fibers using immunohistochemical reactions for alpha-tubulin and Luxol Fast Blue stains for myelin. Antibodies to tight junction protein claudin-1 were used to study perineurial cells. We identified Schwann cells (neurolemmocytes) and macrophages with the reaction for GFAP and the Iba-1 protein IHC reaction, respectively. Results. After 7 days, we observed degeneration of most nerve fibers, disintegration of myelin sheaths, disruption of the blood-neural barrier, migration of hematogenous macrophages, and dedifferentiation of Schwann cells in the endoneurium of the rat sciatic nerve distal segment. However, after day 21, the growth of nerve fibers from the proximal segment of the nerve and their remyelination were observed. The density of nerve fibers reached its highest value 60 days after the injury. Conclusion. We evaluated the relationship between the degree of myelin breakdown and the number of Iba-1+ macrophages, detected changes in the perineurium in the distal segment of the nerve, and identified dedifferentiated mitotically dividing Schwann cells. Keywords: Wallerian degeneration, damaged rat nerve, Luxol Fast Blue, claudin-1, Iba-1 protein, GFAP, immunohistochemistry

 Ключевые слова валлеровская дегенерация поврежденный нерв крысы люксолевый прочный синий клаудин-1 белок Iba-1 GFAP иммуногистохимия Keywords Wallerian degeneration damaged rat nerve Luxol Fast Blue claudin-1 Iba-1 protein GFAP immunohistochemistry Исследование выполнено в рамках государственного задания Института экспериментальной медицины (№ FGWG-2022-0002). The study was carried out within the framework of State Assignment to Institute of Experimental Medicine (No. FGWG-2022-0002). Sarhane KA, Qiu C, Harris TGW, Hanwright PJ, Mao HQ, Tuffaha SH. Translational bioengineering strategies for peripheral nerve regeneration: opportunities, challenges, and novel concepts. Neural Regen Res. 2023;18(6):1229–34. DOI: 10.4103/1673-5374.358616. Литвиненко И.В., Одинак М.М., Живолупов С.А., Булатов А.Р., Рашидов Н.А., Бардаков С.Н. Клинико-инструментальные характеристики травматических поражений периферических нервов конечностей. Вестник Российской Военно-медицинской академии. 2018;3(63):50–56. Доступно по адресу: https://elibrary.ru/item.asp?id=37298620 (получено 01.12.2022). Litvinenko IV, Odinak MM, Zhivolupov SA, Bulatov AR, Ra shidov NA, Bardakov SN. Clinical and instrumental characteristics of traumatic lesions of peripheral nerves of limbs. Bulletin of the Russian Military Medical Academy. 2018;3(63):50–56 (In Russ.). Available from: https://elibrary.ru/item.asp?id=37298620 (accessed 01.12.2022). Ништ А.Ю., Фомин Н.Ф. Нерешенные проблемы реконструктивной хирургии периферических нервов. Вестник экспериментальной и клинической хирургии. 2019;12(2):127–133. DOI: 10.18499/2070-478X-2019-12-2-127-133. Nisht AYu, Fomin NF. Unsolved problems of peripheral nerves reconstructive surgery. Journal of Experimental and Clinical Surgery. 2019;12(2):127–133 (In Russ.). DOI: 10.18499/2070-478X-2019-12-2-127-133. Chu XL, Song XZ, Li Q, Li YR, He F, Gu XS et al. Basic mechanisms of peripheral nerve injury and treatment via electricalstimulation. Neural Regen Res. 2022;17(10):2185–93. DOI: 10.4103/1673-5374.335823. Тутуров А.О., Пятин В.Ф., Сергеев С.М. Перспективы развития технологий восстановления протяженных дефектов нервов с помощью кондуитов. Политравма. 2019;2:95–101. Доступно по адресу: https://elibrary.ru/item.asp?id=38557462 (получено 01.12.2022). Tuturov AO, Pyatin VF, Sergeev SM. Prospects for development of technologies for restoration of extended nerve defects with use of conduits. Polytrauma. 2019;2:95–101 (In Russ.). Available from: https://elibrary.ru/item.asp?id=38557462 (accessed 01.12.2022). Sarker MD, Naghieh S, McInnes AD, Schreyer DJ, Chen X. Regeneration of peripheral nerves by nerve guidance conduits: Influence of design, biopolymers, cells, growth factors, and physical stimuli. Prog Neurobiol. 2018;171:125–50. DOI: 10.1016/j.pneurobio.2018.07.002. Parker BJ, Rhodes DI, O’Brien CM, Rodda AE, Cameron NR. Nerve guidance conduit development for primary treatment of peripheral nerve transection injuries: a commercial perspective. Acta Biomater. 2021;135:64–86. DOI: 10.1016/j.actbio.2021.08.052. Ништ А.Ю., Чирский В.С., Фомин Н.Ф. Морфологическая характеристика изменений периферических нервов и тканей таргетных зон при соединении периферических нервов по типу «конец в бок» в эксперименте. Клиническая и экспериментальная морфология. 2020;9(1):40–48. DOI: 10.31088/CEM2020.9.1.40-48. Nisht AYu, Chirskij VS, Fomin NF. Morphological characteristics of changes in peripheral nerves and tissues of target zones after the “end to side” neurorraphy in an experiment. Clinical and experimental morphology. 2020;9(1):40–48 (In Russ.). DOI: 10.31088/CEM2020.9.1.40-48. Mathot F, Shin AY, van Wijnen AJ. Targeted stimulation of MSCs in peripheral nerve repair. Gene. 2019;710:17–23. DOI: 10.1016/j.gene.2019.02.078. Kubiak CA, Grochmal J, Kung TA, Cederna PS, Midha R, Kemp SWP. Stem-cell-based therapies to enhance peripheral nerve regeneration. Muscle Nerve. 2020;61(4):449–59. DOI:10.1002/mus.26760. Siemionow M, Strojny MM, Kozlowska K, Brodowska S, Grau-Kazmierczak W, Cwykiel J. Application of human epineural conduit supported with human mesenchymal stem cells as a novel therapy for enhancement of nerve gap regeneration. Stem Cell Rev Rep. 2022;18(2):642–59. DOI: 10.1007/s12015-021-10301-z. Петрова Е.С., Колос Е.А. Регенерация нервных волокон седалищного нерва крысы после повреждения и введения мезенхимных стволовых клеток. Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2020;106(9):1059–1068. DOI: 10.31857/S0869813920070055. Petrova ES, Kolos EA. Regeneration of nerve fibers of the rat sciatic nerve after damage and injection of MSCs. Russian Journal of Physiology. 2020;106(9):1059–1068 (In Russ.). DOI: 10.31857/S0869813920070055. Masgutov R, Zeinalova A, Masgutova G, Salafutdinov I, Garanina E, Syromiatnikova V et al. Angiogenesis and nerve regeneration induced by local administration of plasmid pBud-coV EGF165-coFGF2 into the intact rat sciatic nerve. Neural Regen Res. 2021;16(9):1882–9. DOI: 10.4103/1673-5374.306090. Idrisova KF, Zeinalova AK, Masgutova GA, Bogov AA, Allegrucci C, Syromiatnikova VY et al. Application of neurotrophic and proangiogenic factors as therapy after peripheral nervous system injury. Neural Regen Res. 2022;17(6):1240–7. DOI: 10.4103/1673-5374.327329. Kerns JM, Walter JS, Patetta MJ, Sood A, Hussain AK, Chung JJ et al. Histological assessment of Wallerian degeneration of the rat tibial nerve following crush and transection injuries. J Reconstr Microsurg. 2021;37(5):391–404. DOI: 10.1055/s-0040-1716870. Петрова Е.С., Колос Е.А. Iba-1-иммунопозитивные клетки в седалищном нерве крысы в норме и при патологии. В сб.: Современная нейробиология: фундаментальные исследования и практические аспекты. Уфа: РИЦ БашГУ, 2022. С. 226–230. DOI: 10.33184/snfipa-2022-10-19.24. Petrova ES, Kolos EA. Iba-1-immunopositive cells in the sciatic nerve of rats in normal and pathological conditions. In: Sovremennaya neirobiologiya: fundamental’nye issledovaniya i prakticheskie aspekty. Ufa: RIC BashGU, 2022. P. 226–230 (In Russ.). DOI: 10.33184/snfipa-2022-10-19.24. Otake K, Toriumi T, Ito T, Okuwa Y, Moriguchi K, Tanaka S et al. Recovery of sensory function after the implantation of oriented-collagen tube into the resected rat sciatic nerve. Regen Ther. 2020;14:48–58. DOI: 10.1016/j.reth.2019.12.004. Петрова Е.С., Колос Е.А. Иммуногистохимическое исследование периневрия. В сб.: Современные аспекты морфологии, патоморфологии и онкопатологии организма человека. Курск: Издательство КГМУ, 2022. С. 296–303. DOI: 10.21626/cb.22.humanmorphology. Petrova ES, Kolos EA. Immunohistochemical study of the perineurium. In: Sovremennye aspekty morfologii, patomor-fologii i onkopatologii organizma cheloveka. Kursk: Izdatel’stvo KGMU, 2022. P. 296–303 (In Russ.). DOI: 10.21626/cb.22.hu-manmorphology. Ubogu EE. Biology of the human blood-nerve barrier in health and disease. Exp Neurol. 2020;328:113272. DOI: 10.1016/j.expneurol.2020.113272. Tsukita S, Tanaka H, Tamura A. The claudins: from tight junctions to biological systems. Trends Biochem Sci. 2019;44(2):141–52. DOI: 10.1016/j.tibs.2018.09.008. Reinhold AK, Schwabe J, Lux TJ, Salvador E, Rittner HL. Quantitative and microstructural changes of the blood-nerve barrier in peripheral neuropathy. Front Neurosci. 2018;12:936. DOI: 10.3389/fnins.2018.00936 Xu J, Wen J, Fu L, Liao L, Zou Y, Zhang J et al. Macrophage-specific RhoA knockout delays Wallerian degeneration after peripheral nerve injury in mice. J Neuroinflammation. 2021;18(1):234. DOI: 10.1186/s12974-021-02292-y. Kolos EA, Korzhevskii DE. Spinal cord microglia in health and disease. Acta Naturae. 2020;12(1):4–17. DOI: 10.32607/actanaturae.10934. Kwilasz AJ, Green Fulgham SM, Ellis A, Patel HP, Duran-Malle JC, Favret J et al. A single peri-sciatic nerve administration of the adenosine 2A receptor agonist ATL313 produces long-lasting anti-allodynia and anti-inflammatory effects in male rats. Brain Behav Immun. 2019;76:116–25. DOI: 10.1016/j.bbi.2018.11.011. Kolter J, Kierdorf K, Henneke P. Origin and differentiation of nerve-associated macrophages. J Immunol. 2020;204(2):271–9. DOI: 10.4049/jimmunol.1901077. Stratton JA, Holmes A, Rosin NL, Sinha S, Vohra M, Burma NE et al. Macrophages regulate Schwann cell maturation after nerve injury. J Cell Rep. 2018;24(10):2561–72.e6. DOI: 10.1016/j.celrep.2018.08.004.