кандидат медицинских наук; доцент кафедры нормальной и топографической анатомии с оперативной хирургией (ФГБОУ ВО Чувашский государственный университет имени И.Н. Ульянова)
доктор медицинских наук, профессор; директор медицинского института (ФГБОУ ВО Марийский государственный университет)
доктор медицинских наук; профессор кафедры нормальной и топографической анатомии с оперативной хирургией (ФГБОУ ВО Чувашский государственный университет имени И.Н. Ульянова)
кандидат медицинских наук; доцент кафедры нормальной и топографической анатомии с оперативной хирургией (ФГБОУ ВО Чувашский государственный университет имени И.Н. Ульянова)
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Будущее современного общества в значительной степени зависит от здоровья новорожденных и детей, что отражает и определяет здоровье всего населения в целом. Увеличение показателей заболеваемости среди детского населения является логичным следствием снижения уровня общего здоровья женщин детородного возраста [1, 2]. Состояние здоровья женщин зависит от множества факторов, которые косвенно или напрямую влияют на течение беременности [3, 4]. В настоящее время сохраняется увеличение числа беременностей, протекающих на фоне вторичных иммунодефицитных состояний, вызванных как внутренними, так и внешними факторами, в том числе инфекционными процессами, хроническими заболеваниями, приемом лекарственных препаратов на постоянной основе, травмами, оперативными вмешательствами и развитием опухолей. Во время пандемии COVID-19 значительное число беременностей было скомпрометировано течением новой коронавирусной инфекции [5]. Сведений о влиянии такого состояния иммуносупрессии во время беременности на развитие иммунных органов у потомства недостаточно, а затруднения в воспроизведении соответствующей экспериментальной модели заставляют ученых продолжать поиск новых данных. Зная максимально полный патогенез влияния различных иммунодефицитных состояний на развитие иммунных органов у плода, можно снизить высокий уровень управляемой патологии детского возраста путем адекватной прегравидарной подготовки женщины.
Как известно, состояние иммунной системы матери до беременности и во время нее имеет решающее значение для пренатального программирования иммунного статуса у зародыша, которое будет играть большую роль в становлении иммунитета и после рождения ребенка [3, 6]. Индивидуальные черты строения и функционирования иммунных органов матери зародыш наследует через так называемый эпигенетический материнский иммунный импринтинг [7]. Этот механизм обеспечивает будущему потомству превентивную иммунную резистентность к наиболее часто встречающимся антигенам [3, 8], сбои в нем могут приводить к появлению аллергии, аутоиммунной патологии и даже развитию опухолей у ребенка [3, 4]. Несмотря на то, что механизмы влияния состояния иммунной системы матери до беременности и во время внутриутробного периода на развитие иммунных органов плода изучаются в экспериментальных условиях на лабораторных животных на протяжении многих лет [9–11], в этой проблеме еще много белых пятен.
Одной из самых чувствительных к действию внешних и внутренних факторов в организме является иммунная система, важным звеном которой служит селезенка. Ее уникальное строение позволяет совмещать функции лимфоидного органа и органа гемопоэза [9, 12, 13]. Это самый крупный лимфоидный орган, который при возникновении опухоли становится источником клеток ее микроокружения. К ним относятся селезеночные макрофаги и дендритные клетки, а также В- и Т-лимфоциты [14–16]. Возможно, они участвуют в формировании так называемых третичных лимфоидных структур (ТЛС) в самой опухоли, непосредственно влияющих на рост, прогрессирование и метастазирование рака [17, 18]. Влияние селезенки на онкогенез недостаточно изучено, и до сих пор у ученых нет полного понимания роли клеток селезенки в феномене крайне редкого метастазирования в нее при канцерогенезе [19, 20]. Больше того, многие клиницисты до сих пор не понимают уникальность селезенки, вследствие чего спленэктомия наряду с аппендэктомией рассматривается как вмешательство, не имеющее серьезных последствий [21, 22]. Тем не менее существует множество данных о высокой значимости спленэктомии в развитии иммунодефицитных состояний [21, 23–25] и усугублении онкогенеза [18, 20]. Качество формирования противоопухолевого иммунного ответа во многом зависит от пролиферации Т- и В-лимфоцитов в иммунокомпетентных компартментах селезенки [15, 26].
Цель исследования – оценить морфологическую структуру селезенки и пролиферативную активность ее клеток на фоне экспериментального онкогенеза у потомства иммунокомпрометированных крыс-самок.
Исследование проведено на 150 белых нелинейных крысах-самцах, распределенных на четыре группы: 1-я – потомство интактных крыс (контроль), n=30; 2-я – потомство иммунокомпрометированных крыс-самок, n=40; 3-я – потомство интактных крыс-самок, у которых был смоделирован канцерогенез, n=40; 4-я – потомство иммунокомпрометированных крыс-самок, у которых также был вызван канцерогенез, n=40. В качестве иммунокомпрометирующего фактора была выбрана спленэктомия, которую проводили крысам-самкам за 1 месяц до спаривания. Потомство интактных крыс получали от спаривания интактных самок с интактными самцами. По достижении возраста 1 месяц потомству интактных и иммунокомпрометированных крыс для моделирования аденокарциномы толстой кишки вводили канцероген 1,2-диметилгидразин (Acros Organics, Бельгия) согласно R.F. Jacoby et al. (1991). Водный раствор 1,2-диметилгидразина вводили один раз в неделю интраперитонеально в дозе 20 мг/кг в течение 4 недель (общая курсовая доза составила 80 мг/кг). Для того чтобы нивелировать воздействие стрессового фактора на результаты от инъекций канцерогена, крысам группы контроля интраперитонеально вводили 0,9% раствор NaCl по 0,5 мл с той же периодичностью, что и канцероген. Через 4 месяца после окончания курса инъекций животных декапитировали. Все манипуляции с крысами проводили согласно требованиям Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов (Страсбург, 1986). Исследование одобрено на заседании локального этического комитета медицинского факультета Чувашского государственного университета имени И.Н. Ульянова (протокол № 20-01 от 29.01.2020).
Для гистологического исследования парафиновые срезы селезенки окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике. С помощью цифровой фотокамеры Canon DS126191 (Canon, Тайвань), люминесцентного микроскопа «Микромед 3 Люм» («Микромед», Россия) и программы «Микро-Анализ» (Labor-Microscopes, Россия) на полученных цифровых снимках оценивали стромально-паренхиматозное отношение, соотношение белой и красной пульпы, долю первичных и вторичных лимфоидных узелков.
Для идентификации клеточной пролиферации парафиновые срезы селезенки толщиной 4 мкм окрашивали иммуногистохимически с использованием моноклонального антитела к маркеру клеточной пролиферации Ki67 (клон ММ-1, Santa Cruz Biotechnology, США) с применением системы визуализации Leica ChromoPlex™ 1 Dual Detection for BOND (Leica Biosystems, Германия) и докрашиванием гематоксилином. Для оценки выраженности реакции на Ki67 проводили подсчет позитивно окрашенных (коричневым цветом) ядер с последующим расчетом индекса пролиферации (IKi67) по формуле IKi67 = (n/N) × 100, выражаемого в процентах, где n – число позитивных ядер к белку Ki67, N – общее число ядер в поле зрения микроскопа. Подсчеты проводили на микрофотографиях при ×900 в 10 случайных полях зрения каждого среза с учетом только ядерного окрашивания без анализа его интенсивности и особенностей прокрашивания ядер. Подсчет клеток в герминативных центрах белой пульпы селезенки осуществляли отдельно, выбирая в них при этом участки с наибольшим уровнем выраженности реакции на Ki67 [27].
Полученные данные обрабатывали с помощью программы Statistica 10.0 (StatSoft, США). Были использованы стандартные методы параметрической и непараметрической статистики. Для определения типа распределения применяли критерий Колмогорова–Смирнова с поправкой Лиллиефорса. При нормальном распределении данных брали t-критерий Стьюдента и такие стандартные показатели, как средняя арифметическая величина М и средняя ошибка средней арифметической величины m. При распределении, отличающемся от нормального, использовали U-критерий Манна–Уитни для двух групп и Краскела–Уоллиса при сравнении трех исследуемых групп, при этом выборки описывали через медиану (Ме), нижний и верхний квартили (Q1 и Q3). Статистически значимыми считали различия между группами при p<0,01.
На окрашенных гематоксилином и эозином срезах селезенка крыс контрольной группы имела типичную картину с хорошо выраженными структурами белой, красной пульпы и немногочисленного стромального компонента в виде светло-розовой капсулы и соединительнотканных трабекул в толще красной пульпы (рис. 1 A). Красная пульпа была равномерно оксифильная, умеренного кровенаполнения, доля ее площади со структурами стромального компонента – около 80%. Доля белой пульпы, представленной периартериальными лимфоидными муфтами (ПАЛМ) и лимфоидными узелками (ЛУ), составила около 20%. ПАЛМ в основном представлены лимфоцитами, а также крупными клетками, которые могут относиться к интердигитальным дендритным клеткам или к макрофагам. Среди ЛУ присутствовали как первичные, так и вторичные. Первичные ЛУ имели округлую или овальную форму, четкие края и равномерную базофильную окраску за счет преобладающей в них популяции клеток – лимфоцитов. Вторичные ЛУ отличались от первичных ЛУ большими размерами и характерным зональным строением с четкой дифференцировкой на светлый герминативный центр, ПАЛМ, мантийную и маргинальную зоны. Отношение числа первичных ЛУ к вторичным ЛУ составило 1:2,6. Размеры ЛУ сильно варьировали, поэтому мы дифференцировали ЛУ больших размеров (с диаметром более 500 мкм), ЛУ средних размеров (от 300 до 500 мкм) и ЛУ маленького размера (менее 300 мкм). Отношение между ними представлено в таблице 1. При иммуногистохимической обработке срезов селезенки моноклональными антителами к ядерному белку клеточной пролиферации Ki67 выявлено, что такие клетки наиболее многочисленны и плотно расположены друг к другу в герминативных центрах узелков (рис. 2 A). В красной пульпе Ki67+ клетки были расположены диффузно, их численность меньше, чем в белой пульпе (рис. 3 A). Пролиферативная активность клеток наименьшая в мантийной и маргинальной зонах вторичных ЛУ, там обнаруживались лишь единичные клетки, дающие положительную реакцию к Ki67.
Различия по сравнению с группой контроля достоверны при p<0,01 (*) или p<0,001 (**) | The differences compared to the control group are significant at p<0.01 (*) or p<0.001 (**)
В ходе исследования выявлено, что общегистологическое строение селезенки у потомства иммунокомпрометированных крыс обладает рядом особенностей. Красная пульпа имеет ярко-красную окраску за счет полнокровия ее сосудов. Площадь белой пульпы уменьшена в 1,75 раза (p<0,01). Округлая форма первичных ЛУ меняется на неправильную, границы между зонами у вторичных ЛУ становятся несколько стертыми (рис. 1 B). Увеличивается доля ЛУ маленьких размеров в 4 раза (p<0,01), а доля крупных, напротив, уменьшается на 8,05% (p<0,01). Отношение первичных ЛУ ко вторичным ЛУ составляет 1:1,6 (p<0,01) за счет значимого сокращения числа вторичных ЛУ (табл. 1).
Выраженность реакции на Ki67+ в клетках белой пульпы также превалирует над ее интенсивностью в красной пульпе (рис. 2 B и 3 B). Индекс пролиферативной активности в герминативных центрах ЛУ изменяется незначительно (табл. 2). В красной пульпе в результате увеличения числа Ki67+ клеток в поле зрения (рис. 2 B) достоверно возрастает IKi-67 (табл. 2).
Экспериментальный онкогенез, индуцированный введением 1,2-диметилгидразина, у потомства интактных и иммунокомпрометированных крыс отличается. Выявлено, что у потомства иммунокомпрометированных крыс-самок аденокарциномы толстой кишки развиваются на 15% чаще, чем у потомства интактных крыс. При этом у потомства иммунокомпрометированных крыс 52% аденокарцином составили высокодифференцированные опухоли, 41% – умереннодифференцированные, а 7% – низкодифференцированные. У потомства интактных крыс на долю высокодифференцированных и умереннодифференцированных аденокарцином пришлось 63 и 37%, соответственно. Низкодифференцированные опухоли в этой группе исследования не выявлены.
На фоне канцерогенеза у потомства интактных крыс селезенка претерпевает следующие изменения. Красная пульпа отличается неравномерным кровенаполнением (рис. 1 C), ее площадь на 8% больше, чем у группы контроля (p<0,01) (табл. 1). В белой пульпе увеличивается общее количество ЛУ в одном поле зрения (рис. 1 C), преимущественно за счет ЛУ мелкого и среднего размера, их доля от общего числа ЛУ составляет 8 и 45%, соответственно. Доля ЛУ больших размеров сократилась в 1,6 раза и составила всего 47%. Следовательно, изменилось отношение первичных ЛУ ко вторичным, что свидетельствует об уменьшении количества последних. В герминативных центрах ЛУ клетки, экспрессирующие Ki67, расположены менее компактно (рис. 2 C), в 2 раза уменьшается IKi67 (табл. 2). В красной пульпе численность пролиферирующих клеток незначительно уменьшилась (рис. 3 C), а индекс пролиферации остался практически неизменным.
При развитии рака у потомства иммунокомпрометированных крыс микроскопическая картина селезенки характеризуется нечеткостью границ белой пульпы, неравномерной оксифильной окраской красной пульпы с чередованием бледных и ярких, полнокровных, зон (рис. 1 D). Площадь белой пульпы значительно уменьшена и составляет всего 9%, что в 2,3 меньше, чем у группы контроля (p˂0,01) (табл. 1). Общая площадь красной пульпы и стромы на 10% больше, чем у контрольной группы исследования (p<0,01). ЛУ белой пульпы существенно меньше в размере, имеют нечеткие контуры, зональность резко стерта (рис. 1 D). Дифференцировка первичных и вторичных ЛУ затруднена ввиду неярко выраженного герминативного центра у последних (рис. 1 D). Соединительнотканная капсула и трабекулы утолщены. Доля ЛУ большого размера сократилась в 5 раз, а среднего и маленького размера, с небольшими центрами размножения или вовсе без них, наоборот, увеличилась в 2 и 10 раз, соответственно (p˂0,01) (табл. 1). Таким образом, на фоне онкогенеза в толстой кишке доля крупных узелков в селезенке является наименьшей по сравнению с другими группами исследования, а доля мелких и средних – наибольшей. Отношение первичных ЛУ ко вторичным из-за трудности их дифференцировки между собой составляет всего 1:0,5, что существенно меньше, чем у контрольной группы исследования.
В герминативных центрах вторичных ЛУ значительно сокращается доля пролиферирующих клеток с реакцией на Ki67 (рис. 2 D). Клеточная пролиферация уменьшилась не только по сравнению с контрольной группой, но и по сравнению с потомством интактных крыс, у которых также был моделирован канцерогенез (табл. 2). В красной пульпе доля Ki67+ клеток изменяется статистически незначимо (рис. 3 D).
В текущем исследовании удаление селезенки у крыс-самок послужило серьезным иммунокомпрометирующим воздействием перед тем, как у них наступила беременность. Факт супрессивного влияния спленэктомии на иммунитет подтверждается многочисленными исследованиями [25, 28–30], по данным которых известно, что после подобного вмешательства происходит снижение концентрации в крови иммуноглобулинов, в результате чего падает опсонизирующая и фагоцитарная активность крови. В сыворотке уменьшается содержание СD3+, CD4+, CD8+, CD20+, CD45RA+ лимфоцитов, компонентов комплемента, возрастает концентрация CD16+, CD57+, NK-клеток и провоспалительных цитокинов [25, 29]. В ходе работы было выявлено, что протекание беременности на фоне аналогичного иммунокомпрометирующего состояния, также вызванного спленэктомией, приводит у потомства к некоторым изменениям в селезенке, касающимся ее микроскопического строения: уменьшается площадь белой пульпы, увеличивается площадь красной пульпы и стромального компонента, уменьшается число вторичных иммуноактивных лимфоидных узелков белой пульпы. По нашему мнению, подобные изменения в селезенке связаны с ее отставанием в развитии и замедлением трансформации из органа кроветворения в орган иммунной системы [9, 11, 26]. Стоит отметить, что индекс пролиферации клеток белой пульпы при этом меняется незначительно, что можно расценить, по нашему мнению, как сохранение пролиферативной активности клеток селезенки при данном состоянии. Однако герминативные центры вторичных ЛУ селезенки потомства оказались наиболее чувствительными к действию такого иммунокомпрометирующего фактора, как спленэктомия, на материнский организм. При этом IKi67 в красной пульпе, напротив, значимо увеличен, что может свидетельствовать о напряженности экстрамедуллярного гемопоэза.
В данной работе предпринята попытка выяснить, влияют ли подобные вмешательства в иммунную систему матери до беременности на микроструктуру селезенки и пролиферативную активность ее клеток у потомства на фоне канцерогенеза в толстой кишке. Показано, что при развитии опухоли в толстой кишке наибольшие изменения претерпевает селезенка именно у потомства иммунокомпрометированных крыс. По сравнению с потомством интактных животных у него более выражена гипоплазия белой пульпы, более значимо увеличивается доля красной пульпы и стромы, значительнее сокращается доля вторичных ЛУ, в герминативных центрах которых был зафиксирован самый наименьший показатель IKi67. В красной пульпе индекс пролиферации у них изменяется незначительно, что может свидетельствовать о пониженной реактивности структур селезенки, участвующих в экстрамедуллярном гемопоэзе, на фоне канцерогенеза. Следует отметить, что ЛУ селезенки по структуре и клеточному составу схожи с ТЛС, которые появляются в опухолях или хронически воспаленных тканях. При этом наличие в их герминативных центрах Ki67+ клеток является признаком зрелости данных структур и связано с улучшением прогноза и выживаемости при колоректальном раке, и, наоборот, отсутствие зрелых ТЛС (без пролиферирующих герминативных центров) в опухоли было определено как неблагоприятный прогностический индикатор [18]. В нашем случае первичные ЛУ без центров размножения и Ki67+ клеток можно сравнить с незрелыми ТЛС, а вторичные, содержащие Ki67+ герминативные центры, со зрелыми ТЛС, поэтому более выраженное снижение интенсивности клеточной пролиферации в селезенке у потомства иммунокомпрометированных самок наряду с уменьшением численности вторичных ЛУ и площади белой пульпы может быть одним из предикторов иммунодефицитного состояния, которое в дальнейшем приводит к прогрессированию опухоли.
По нашему мнению, удаление селезенки незадолго до наступления беременности приводит к недостаточности всех звеньев иммунитета у матери, а в дальнейшем негативно влияет на закладку и развитие иммунных органов у потомства [3, 11, 26, 29, 31]. Одной из причин выраженного иммунодефицита у самок после спленэктомии может быть устойчивое увеличение у них в крови уровня кортизола, который регистрируется даже в отдаленные сроки после операции [11, 23]. Соответственно, недостаточная пассивная иммунизация потомства спленэктомированных крыс-самок вследствие вторичного иммунодефицитного состояния сначала в эмбриональный период через плаценту, а затем в период новорожденности через материнское молоко также нарушает процессы становления иммунной системы у потомства [6, 7]. Вероятно, все это приводит к задержке в развитии селезенки и ее незрелости в постэмбриональный период, что, в свою очередь, становится причиной ослабления противоопухолевого иммунного ответа у потомства иммунокомпрометированных крыс.
В